细胞冻存与复苏实验攻略

1、取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。

2、用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。

3、用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。

4、将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。

5、将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。

6、加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。

7、将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳培养箱中培养。

1、倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。

2、培养液瓶打开后，过酒精灯火焰，置酒精灯火焰周围。

3、拿出直头滴管，套上橡皮吸头，过火，放入培养液瓶中。

4、打开培养瓶，瓶口过火，将培养瓶内的培养液轻轻倒入废液缸，用2-3mLPBS洗去残留的旧培养基。

5、培养瓶加入0.25%胰酶（大约2ml）用量以薄薄盖满一层为宜，37℃消化，倒置显微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉，加入少量的含血清的新鲜培养基。

6、取弯头滴管反复吹打细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基，制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

7、对半贴壁培养细胞，不需胰酶，直接吹打，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

1、吸取传代后的细胞悬液，离心，去除培养液，加入冻存液，分装冻存管（冻存管内细胞数目一般为（5～10）×10万个/ml，2ml冻存管中一般放1～1.5ml细胞）。

2、冷冻保存方法一：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

3、冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之程序降温机中每分钟降1～3℃至-80℃以下，再放入液氮长期保存。

1、取出冷冻管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。

2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

3、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

4、加适当培养液后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。