CRISPR-Case9载体构建步骤
1、1. Adapter 制备
按下述10 μl体系制备adapter：
引物F（终浓度1.0 μM） 10 μM的引物1 μl
引物R（终浓度1.0 μM） 10 μM的引物1 μl
0.5×TE或ddH2O 8 μl
90℃孵育10 s，然后置于室温。
2、2. sgRNA表达盒制备
每个sgRNA表达盒按以下体系进行反应：
1 μl 10×Cutsmart Buffer
10-20 ng pYLsgRNA （取20ng）
ATP（终浓度0.5-1.0 mM）（取1.0 mM）
0.3-0.5 μl adapter（终浓度0.03-0.05 μM）
3 U BsaI-HF
20 U T4 DNA 连接酶（用1×T4 DNA ligase buffer稀释）
ddH2O加至终体积10 μl
PCR反应，37℃ 5 min ，20℃ 5min，5个循环。注意：不要用热盖，同时避免酶过量、反应时间过长。
3、3. PCR
第一轮PCR：
将上一步得到的sgRNA表达盒稀释10倍，按Phanta 25 μl体系进行反应（此轮反应中，每个目的编辑基因包含两个独立反应）：
2×Phanta Buffer 12.5 μl
10×dNTP 0.5 μl
引物 1 μl +1 μl（UF/RP，FP/gR-R，FP和RP分别为adapter正反向引物）
sgRNA-adapter 1.5 μl
Phanta 0.5 μl
ddH2O 7.5 μl
反应程序：
预热 95℃ 5 min
变性 95℃ 15 s
退火 60℃ 15 s
延伸 72℃ 20 s
最终延伸 72℃ 10 min
28个循环
第二轮PCR（将第一轮PCR产物稀释10倍，将目的编辑基因对应产物等量混合）：
预热 95℃ 5 min
变性 95℃ 15 s
退火 58℃ 15 s
延伸 72℃ 40 s
最终延伸 72℃ 10 min
30个循环
切胶回收
扩增sgRNA盒对应长度：LacZ-OsU6a-sgRNA=832 bp; OsU6a-sgRNA=629 bp; OsU6b-sgRNA=515 bp; LacZ-OsU3m-sgRNA=767 bp; OsU3msgRNA=564 bp
4、4. Cas9载体构建
设置如下反应：
1.5 µl 10×CutSmart buffer
ATP （终浓度1.0 mM, 或加1µl 10 x NEB T4 DNA ligase buffer）
60-100 ng pYLCRISPR/Cas9
10-100 ng sgRNA cassettes
10 U BsaI-HF
40 U T4 DNA ligase
ddH2O至15 µ
sgRNA盒对应量：
1 10 ng
2 20-30 ng
3 40-50 ng
4 60-70 ng
载体和插入片段摩尔比：1:4-6。
PCR反应：
37℃ 10 min
10℃ 5 min
20℃ 5 min
以上3个循环
37℃ 3 min
10℃ 5 min
20℃ 5 min
以上10个循环。