沙门氏菌（PCR-荧光探针法）试剂盒检测沙门氏菌

1、1． 基因组提取

（1） 取培养后的菌液约1.5ml，12000rpm离心2min，去上清。

（2） 加入200μl无菌水，充分混匀，12000rpm离心2min，去上清。

（3） 加入80μl核酸提取液，用移液器吹吸混匀，50℃水浴1小时，100℃水浴15分钟，冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。

（4） 取上清用于荧光PCR检测。

2、1． 荧光定量PCR检测

按下列组份配制反应液（反应液配制请在冰上进行）

沙门氏菌荧光PCR反应液：        5.7μl

Taq酶：                                  0.3μl

样品DNA或阴阳性对照品：       5μl

DEPC H2O：                           14μl

PCR扩增

           95℃ 2 min       95℃ 15 sec      60℃ 1 min        

    荧光检测在60℃，反应体系为25μl，荧光通道选用FAM通道。

3、【结果判读】

1，基线的设定

对于ABI系列仪器，分析前把参比荧光定为none，如果没有Ct<16的强阳性标本，就选3-15个循环的平均荧光信号为基线分析；如果有Ct<16的强阳性标本，就将此标本定为AFUMI DNA>1010 copy/ml，并将此样品从数据库中剔除，再以3-15个循环的平均荧光信号为基线再分析Ct。

对于iCycler仪器，基线一般按照自设值（2-10）即可，在实验结束后，选择PCR baseline substract选项扣除基线值。若某些曲线出现了规则的剧烈的跳动，应视为非正常情况，将其从结果中剔除（击活select wells,将此孔彩色点去，然后选择display wells）并注意调整坐标，使所有曲线都在坐标以内。

对于lightcycler仪器，用荧光记数值F1/F2读取结果。基线设定原则以超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值不出现任何数值为准（一般在0.001-0.05范围内）。

2，阈值的设定

    应在扩增曲线的指数增长期内且高于阴性对照品的扩增曲线最高点，推荐将阈值设定在从指数增长期转入线性增长期的拐点处。

3，结果分析

Ct值无任何数值                      阴性结果

38≤Ct值<40（重新检测2次） 复检2次，Ct值无，阴性结果

                                            复检2次，其中至少1次Ct值<40，阳性结果

Ct值<38                               阳性结果