ELISA方法检测（血清中）抗体浓度

1、方法：

1.         配制抗原包被液。

2.        将配好的抗原包被液加入到加样槽中，使用12 channel pipette (使用前需用手将每一个tip头压紧) 加入96-well 酶标板中，每孔100ul。加样时要注意避免气泡并避免液体粘附于孔壁。加样时使pipette的各个tip对准96-well一行中的各个孔，按照由B行至G行的顺序，逐行加入。

2、1.        将96-well酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后， 4℃ 冰箱中孵育过夜。

2.        第二天，将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

3.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×PBS，每孔300ul。

4.        室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

5.        重复步骤5和6，共计三次。 

6.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入Blocking solution，每孔300ul。

7.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。(37℃ or lower?)

8.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

9.        使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入PBST，每孔300ul。

10.    室温静置3min，弃溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

11.    重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

12.    ※将稀释好的抗体依次加入到相应的孔中，每个样品做三个复孔，每孔100ul。(加样方法，方向如下。)

3、1.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。

2.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

3.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

4.        使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution，每孔100ul。

5.        将酶标板用保鲜膜包裹（或加盖）后，置于37℃恒温培养箱中孵育1h。

6.        将96-well 板取出，弃其中溶液，并在洁净的纸巾上轻轻拍干。

7.        重复步骤11和12，共计5次。 重复步骤5和6，共计2次。

8.        确保环境温度为25℃，使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well 板中逐排加入TMB溶液，每孔100ul。

9.        25℃下，保温3min，立即使用12-channel pipette(用手将每一个tip头压紧) 按照加抗原包被液的方式，向96-well板中加入2M H2SO4 溶液终止反应。

10.    静置5min后，将96-well板置于FlexStation III 于450nm检测读数。 (在FlexStation III的工作站软件中选择Endpoint/HRP-TMB 方法)

※  抗体稀释方法：

Prepare 0.1ug/ml antibody solution；

Then to prepare antibody working solution as below：