Gateway 体系一步 PCR 法构建 CRISPR 终载体

1、 PCR 扩增

将 OJP001/002 和靶点正反向引物同时加入反应体系中
Template  0.2 ul

Mix  7ul

OJP001/002  0.6ul

Spacer-F/R  0.4ul

KOD-FX  0.2

ddH2O  1.6ul

PCR 反应程序：
94℃ 2’ →( 98℃ 10’ →’ 55℃ 20’ →’ 68℃ 1’ ) X 45 cycles → 68℃ 5’ →25℃

2、 LR 反应

PCR 产物（0.4uL） 与 PJE045 做 LR 反应（可以做 1uL 体系） 3h 以上， 电转（热
激转化） 。

3、 菌落 PCR

U3-temp: OJP008& OJP026 做菌落 PCR（411 bp） ， 提质粒、 OJP026 测序。
U6a-temp: OJF320& OJP026 做菌落 PCR（800 bp） ， 提质粒、 OJP026 测序。

4、引物信息

5、质粒图谱