诱导重组质粒的表达方法

1、首先，先构建质粒的重组子，再将重组子转化到DNA中，再挑选单克隆并检测阳性菌送公同进行测序，将测序正确的菌株扩大培养并提质粒。

2、然后，再转化至大肠杆菌的感受态细胞中，挑选单克隆于5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37C振荡培养10 h左右，检测阳性菌送公司测序，将测序正确的菌株按1:100比例扩大培养。

3、然后，调整原核细胞的表达条件，分别设置诱导温度为16°C、24'C、28C、33C、37*C和诱导时间(10h、2h、3h、4h、5 h)及IPTG 浓度(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L)进行摸索。

4、然后，再经过SDS-PAGE凝胶电泳检测进行分析，确定Pm-cyclin Y的最优表达条件，并在该条件下，大量诱导表达重组菌液200mL，离心收集菌体，超声破碎得到包涵体蛋白，用带有His和HRP双标签的抗体Western-blot方法检测重组蛋白是否挂上His标签。

5、然后，进行目的蛋白大小的克隆，得到的Pm-cyclinY基因，可编码342个氨基酸，预测分子量约为37.6 kD, 选用的酶切位点是XhoI和EcoRI，根据载体pET21a 的质粒结构，从表达起始到目的片段F引物的XhoI位点，需要再加上约0.6 kD, 故此，目的片段约为38.2 kD。

6、最后，进行Western的检测，检查是否杂交上His标签，使用His-HRP 双标签抗体。SDS-PAGE和Western检测得到的目的条带都约为38 kD。且纯化得到的蛋白做多克隆抗体，为后续实验做准备材料。