PCR-SSCP原理和操作步骤

1、  PCR反应（同前）

PCR产物经琼脂糖电泳确认。 

2、  PCR反应结束后，取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀，98℃ 变性10分钟，迅速冰浴

3、  非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 

（1）制备50 ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，加 TEMED 25 μl、10%过硫酸铵250 μl，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚段八合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入1´TBE电泳缓冲液，缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

（2）取已变性的5 μl PCR扩增产物加到点样孔中，以20 V/cm 电泳 4~5小时。 

（3）拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1~2遍。

（4）倒入固蚂八斤定液，固定 8~10分钟。 

（5）用蒸馏披称水冲洗1~2遍；倒入银染液，银染10~12分钟。

（6）用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。

（7）用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。